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雌酮酶联免疫检测试剂盒及检测方法和应用

专利号/申请号: ZL201810457757.1
类型: -
专利权人: 新疆医科大学第一附属医院;新疆医科大学
分类: -
联系方式: 13999181488
许可期限: 2024-12-31
许可使用费支付方式和标准: 采用入门费和提成费相结合的方式,其中入门费为5万元,提成费按当年度合同产品净销售额的2%提取。
价格: ¥50000.00
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雌酮酶联免疫检测试剂盒及其检测方法和应用
技术领域
背景技术
发明内容
附图说明
具体实施方式

1.一种雌酮酶联免疫检测试剂盒,其特征在于包括多孔酶标板、酶标记物、雌酮标准品溶液、底物显色液A、底物显色液B、样本稀释液、酶标记物稀释液、第一浓缩洗涤液、第二浓缩洗涤液、终止液,其中,多孔酶标板包被有雌酮单克隆抗体,酶标记物中的酶为辣根过氧化物酶,辣根过氧化物酶标记的抗原为雌酮抗原中的雌酮-6-SCH2CO2H-OVA,雌酮抗原包括雌酮免疫原和雌酮包被原,雌酮-6-SCH2CO2H-OVA为雌酮半抗原与载体蛋白中卵清蛋白的偶联物,雌酮半抗原的分子结构式为 


2.根据权利要求1所述的雌酮酶联免疫检测试剂盒,其特征在于雌酮标准品溶液的浓度范围为0μg/mL至100μg/mL;或/和,底物显色液A为含体积百分含量0.05%至0.08%过氧化氢尿素的磷酸钠柠檬酸溶液;或/和,底物显色液B为含体积百分含量0.04%至0.05%四甲基联苯胺的酸性稳定液;或/和,样本稀释液为小牛血清和磷酸盐缓冲液的混合液,其中,样本稀释液中,小牛血清的体积百分含量为5%至15%,磷酸盐缓冲液的摩尔浓度为0.01moL/L、pH值为7.2至7.4;或/和,酶标记物稀释液为磷酸盐缓冲液和小牛血清的混合液,其中,酶标记物稀释液中,小牛血清的体积百分含量为10%至20%,磷酸盐缓冲液中含有体积百分含量为1%的吐温-20,磷酸盐缓冲液的摩尔浓度为0.01moL/L、pH值为7.2至7.4;或/和,第一浓缩洗涤液为含有体积百分含量为1%的吐温-20的磷酸盐缓冲液,磷酸盐缓冲液的摩尔浓度为0.2moL/L、pH值为7.2至7.4;或/和,第二浓缩洗涤液为摩尔浓度为2%的乙酸溶液;或/和,第二浓缩洗涤液为摩尔浓度为2%的乙酸溶液。

3.根据权利要求1或2所述的雌酮酶联免疫检测试剂盒,其特征在于雌酮单克隆抗体为雌酮鼠源单克隆抗体、雌酮兔源单克隆抗体、雌酮羊源单克隆抗体,是用雌酮免疫原免疫动物后,取抗血清效价为1:2000至1:100000的动物脾脏细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合培养筛选得到的可稳定分泌阳性抗体的杂交瘤细胞株。

4.根据权利要求1或2或3所述的雌酮酶联免疫检测试剂盒,其特征在于多孔酶标板按照下述步骤得到:第一步,在微孔中用包被缓冲液将雌酮单克隆抗体稀释成1.0μg/mL至5.0μg/mL的稀释液,其中,每孔雌酮单克隆抗体中加入100μL包被缓冲液,包被缓冲液是摩尔浓度为0.05moL/L、pH值为9.6的的碳酸盐缓冲液;第二步,稀释液在37℃环境中避光孵育2h或在4℃环境中过夜,倾去孔中液体,用第一浓缩洗涤液稀释20倍后洗涤3次至5次,拍干后,每孔中加入180μL至200μL封闭液,在37℃环境中避光孵育2h,倾去孔中液体,用第一浓缩洗涤液洗涤3次至5次,拍干后真空密闭,得到包被有雌酮单克隆抗体的多孔酶标板,其中,封闭液为含有体积百分含量为2%至5%鱼胶蛋白、5%至10%牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液的混合液,磷酸盐缓冲液的摩尔浓度为0.01moL/L、pH值为7.2至7.4。 

5.根据权利要求1或2或3或4所述的雌酮酶联免疫检测试剂盒,其特征在于雌酮免疫原按照下述步骤得到:第一步,将20mg雌酮半抗原与1mL至5mL N,N-二甲基亚酰胺混合溶解,加入20μL至28μL三正丁胺并搅拌反应30min后,加入17μL至18μL氯甲酸已丁酯,得到第一溶液,第二步,将60mg至90mg牛血清蛋白与5mL磷酸盐缓冲液混合后,在4℃的条件下静置30min,得到第二溶液,其中,磷酸盐缓冲液的浓度为0.01moL·L-1,pH值为7.2至7.4,第三步,将第一溶液滴入第二溶液中并搅拌得到混合液,混合液在4℃条件下搅拌反应18h,第四步,将混合液与磷酸盐缓冲液混合后,于4℃下透析48h,得到雌酮免疫原,其中,磷酸盐缓冲液的浓度为0.05moL·L-1,pH值为7.2至7.4;或/和,雌酮包被原按照下述步骤得到:第一步,将20mg雌酮半抗原与1mL至5mL N,N-二甲基亚酰胺混合溶解,加入20μL至28μL三正丁胺并搅拌反应30min后,加入17μL至18μL氯甲酸已丁酯,得到第一溶液,第二步,将60mg至90mg卵清蛋白与5mL至10mL磷酸盐缓冲液混合后,在4℃的条件下静置30min,得到第二溶液,其中,磷酸盐缓冲液的浓度为0.01moL·L-1,pH值为7.2至7.4,第三步,将第一溶液滴入第二溶液中并搅拌得到混合液,混合液在4℃条件下搅拌反应18h,第四步,将混合液与磷酸盐缓冲液混合后,于4℃下透析48h,得到雌酮包被原,其中,磷酸盐缓冲液的浓度为0.05moL·L-1,pH值为7.2至7.4。 

6.根据权利要求1或2或3或4或5所述的雌酮酶联免疫检测试剂盒,其特征在于雌酮半抗原按照下述制备步骤得到:第一步,室温下,依次向含有270mg雌酮的4mL二甲基甲酰胺溶液中加入225mg至280mg碳酸钾、摩尔浓度为6.7moL/L至8.3moL/L的苄基溴,得到第一混合液,搅拌混合液26h至27h,用水猝灭反应,经乙酸乙酯萃取第一混合液,合并萃取液中有机层,并洗涤、干燥、过滤有机层,收集滤渣,用乙醚洗涤滤渣,得到第一白色固体产物;第二步,将第一白色固体产物、59.1mg至70.2mg新戊二醇和0.52g至0.73g对甲苯磺酸加入到3.4mL苯中,常温下搅拌回流90min并移走水分,冷却至室温,加入饱和碳酸氢钠溶液得到第二混合液,经乙醚萃取第二混合液,得到的萃取液经水洗后,用无水硫酸镁干燥并过滤、浓缩,收集残留物,残留物经硅胶柱纯化,得到第一无色透明固体,其中,硅胶柱中洗脱剂为石油醚和乙酸乙酯,石油醚和乙酸乙酯的体积比为1:60;第三步,第一无色透明固体与甲苯溶解后,与215mg至248mg高锰酸钾、10mg至32mg碳酸氢钠和水混合,氮气作为保护气体,加入30.1mg至47.9mg甲基三烷基氯化铵,在95℃至100℃条件下油浴加热,搅拌17h至19h,得到第三混合液,第三混合液冷却至室温,用硅藻土过滤,得到的滤液用乙醚萃取三次,合并萃取液中有机层,水洗涤有机层,洗涤后的有机层用无水硫酸镁干燥、过滤、浓缩后,经硅胶柱纯化,得到第二白色固体产物,其中,硅胶柱中洗脱剂为石油醚和乙酸乙酯,石油醚和乙酸乙酯的体积比为1:13;第四步,将第二白色固体产物、10mL至15mL甲醇和4mL乙醚混合并将混合液冷却至0℃,加入43mg至65mgNaBH4,得到第四混合液,第四混合液在室温下搅拌1h,蒸发去除溶剂,得到残留物,残留物与水混合后,用乙醚萃取三次,合并萃取液中有机层,有机层用无水硫酸镁干燥、过滤、浓缩后,经硅胶柱纯化,得到第二无色透明固体,其中,硅胶柱中洗脱剂为石油醚和乙酸乙酯,石油醚和乙酸乙酯的体积比为1:10;第五步,向第二无色透明固体中加入135mg至155mgZnI2、10mL干燥后的1,2-二氯乙烷、35μL至45μL巯基乙酸甲酯,得到第五混合液,并以氮气或者氩气作为保护气体,室温下搅拌1h后,用水猝灭反应,经二氯甲烷萃取第五混合液,合并萃取液中有机层,盐水洗涤有机层,洗涤后的有机层用无水硫酸镁干燥、过滤、浓缩后,经硅胶柱纯化,得到巯基乙酸甲酯取代物;第六步,向干燥后的巯基乙酸甲酯取代物中加入10mL至15mL干燥后的1,2-二氯乙烷,并以氮气或者氩气作为保护气体,降温至-5℃,再加入0.32mL至0.48mLBCL3,在0℃下反应4h后,用甲醇猝灭反应,去除溶剂,与水混合,得到第六混合液,经乙酸乙酯和乙醚萃取第六混合液后,合并萃取液中有机层,有机层用无水硫酸镁干燥、过滤、浓缩后,经硅胶柱纯化,得到雌酮半抗原,其中,硅胶柱中洗脱剂为石油醚和乙酸乙酯,石油醚和乙酸乙酯的体积比为4:1。 

7.根据权利要求1或2或3或4或5或6所述的雌酮酶联免疫检测试剂盒,其特征在于载体蛋白为牛血清白蛋白、卵清蛋白、血蓝蛋白和人血清白蛋白中的一种以上。

8.根据权利要求1或2或3或4后5或6或7所述的雌酮酶联免疫检测试剂盒,其特征在于酶标记物采用改良过碘酸钠法将辣根过氧化物酶与雌酮抗原进行偶联后经硼氢化钠还原而得到,其中,辣根过氧化物酶与雌酮抗原的摩尔浓度之比为1∶1。 

9.一种根据权利要求1或2或3或4或5或6或7或8所述的雌酮酶联免疫检测试剂盒的检测方法,其特征在于按照下述步骤进行:第一步,取所需量样本溶液离心,得到样本上清液;第二步,加所需量雌酮标准品溶液、样本稀释液至对应的微孔中,置于37℃避光环境中反应60min;第三步,揭开包被有雌酮单克隆抗体的多孔酶标板的盖板膜,将孔内液体甩干,取250μL/孔的第二洗涤液置于室温下5min后,将孔内液体拍干,再取250μL/孔的第一洗涤液洗涤4次至5次,每次间隔1min,将孔内液体拍干,其中,第二浓缩洗涤液与纯水按照1:4的体积混合得到第二洗涤液,第一浓缩洗涤液与纯水按照1:19的体积混合得到第一洗涤液;第四步,酶标记物稀释液与水按照1:10的体积混合得到酶标记物稀释液,酶标记物稀释液与酶标记物按照体积比为1∶100至1:1000的比例混合均匀,得到酶标记物混合液;第五步,取100μL酶标记物混合液至微孔中,覆盖所有板孔,置于37℃避光环境中反应60min后,将孔内液体拍干,取250μL/孔的第一洗涤液洗涤4次至5次,每次间隔1min,将孔内液体拍干,其中,第一浓缩洗涤液与纯水按照1:19的体积混合得到第一洗涤液;第六步,将底物显色液A和底物显色液B分别以50μL/孔加入微孔内振荡混合均匀,盖板后置于37℃避光环境中显色15min,加入终止液50μL/孔,振荡混合均匀;第七步,将酶标仪设定于450nm处,用双波长450nm/630nm在5分钟内检测每孔的吸光度值并记录数据,根据样本孔的颜色或OD450nm与雌酮标准孔进行比较,从而检测出本样本中雌酮的浓度范围。 

10.一种根据权利要求1或2或3或4或5或6或7或8所述的雌酮酶联免疫检测试剂盒在怀孕母马尿液中雌酮浓度检测或/和临床中血液雌酮浓度检测方面的应用。